Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng Bacillus spp.
từ ao nuôi tôm ở tỉnh Bến Tre
Nguyễn Văn Phúc1, Phan Thị Phượng Trang1,2*
1Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học; 2Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
Tóm tắt
Bacillus là nhóm vi khuẩn hiện diện đa số trong các chế phẩm vi sinh dùng cho nuôi trồng thủy hải sản đặc biệt là nuôi tôm. Chúng có thể được phân lập dễ dàng từ trong đất, nước. Tuy nhiên hiện nay các chủng vi sinh vật và chế phẩm vi sinh vật dùng trong nuôi trồng thủy hải sản đều phải nhập ngoại với giá thành rất cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng Bacillus từ chính các mẫu đất, nước và tôm trong các ao nuôi tôm ở tỉnh Bến Tre. Các chủng vi sinh vật này được sàng lọc để chọn chủng Bacillus an toàn và mang các đặc tính có lợi như: khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase, amylase, protease, lipase và khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chủ yếu trên tôm. Chủng Bacillus tiềm năng được tiến hành định danh và khảo sát biên độ pH, khả năng chịu mặn. Các thông số khảo sát này làm cơ sở cho việc ứng dụng các chủng vi sinh vật này trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh.
Từ khóa: Bacillus, chế phẩm vi sinh, enzyme ngoại bào, Vibrio parahaemolyticus, ao nuôi tôm, tỉnh Bến Tre.
Isolation, identification and determine the beneficial properties of Bacillusspp. strains from shrimp ponds in Ben Tre province
Nguyễn Văn Phúc1; Phan Thị Phượng Trang1,2*
1Center for Bioscience and Biotechnology; 2Laboratory of Molecular Biotechnology, University of Science, Vietnam National University - Ho Chi Minh City, Vietnam.
Abstract
Bacillus is a group of bacteria that presents in the majority of biological products for aquaculture, especially for shrimp. They can be easily isolated from soil and water. However, the contemporary strains and microbial products used in aquaculture must be imported with a very high price. In this study, we isolated some Bacillus strains from soil, water and shrimp samples in shrimp ponds of Ben Tre province. Those safe and beneficial strains were screened as having the ability of extracellular enzyme secretion namely cellulase, amylase, protease, lipase and of growth resistance to the pathogen Vibrio parahaemolyticus that mainly causes disease on shrimp. Potential Bacillus strains were indentical classified and surveyed pH and salinity tolerance. The results of this survey would be the basis for the wide application of this microorganism in the production of biological products.
Keywords: Bacillus, biological products, extracellular enzymes,Vibrio parahaemolyticus, shrimp ponds, Ben Tre province.
Bến Tre là một trong các tỉnh có diện tích nuôi tôm khá lớn, thống kê lên đến 32.086 ha chiếm 73% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản, đạt sản lượng 47.397 tấn vào năm 2013. Tuy nhiên việc nuôi tôm với diện tích lớn và liên tục dẫn đến mất cân bằng sinh thái, ô nhiễm nguồn nước do lượng thức ăn thừa và chất thải từ tôm nuôi dẫn đến tôm nuôi dễ nhiễm các bệnh do virus và vi khuẩn gây ra, làm thiệt hại nặng nề cho người nuôi tôm. Hiện nay chế phẩm vi sinh chứa các vi sinh vật có lợi được dùng như một phương tiện để kiểm soát dịch bệnh bằng cách ức chế, cạnh tranh với những sinh vật có hại, hỗ trợ hệ tiêu hóa, cân bằng vi khuẩn đường ruột [12]. Ngoài ra chế phẩm cũng được dùng trong xử lý ao nuôi bằng cách phân hủy các chất không tiêu hóa được, thức ăn thừa, đặc biệt là rất thân thiện với môi trường [7]. Bacillus là nhóm vi khuẩn có mặt chủ yếu trong các chế phẩm vi sinh vì có những đặc tính có lợi như: (i) làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh các loại enzyme protease, amylase, cellulase, lipase phân hủy các hợp chất hữu cơ, (ii) kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây bệnh như Vibrio do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng (iii) tiết các chất kháng khuẩn, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học [4].
Do đó chúng tôi tiến hành phân lập Bacillus từ các ao tôm ở Bến Tre nhằm tuyển chọn những chủng có các đặc tính có lợi để sử dụng trong các chế phẩm vi sinh cho tôm.
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng Bacillus phân lập từ mẫu đất, mẫu nước và mẫu tôm trong các ao tôm ở tỉnh Bến Tre.
Chủng vi sinh vật kiểm định V. parahaemolyticus được phân lập từ ao tôm bệnh chết (được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh).
2.1.2. Môi trường sử dụng nghiên cứu
Môi trường LB: tryptone 10 g, cao nấm men 5 g, NaCl 5 g, nước cất vừa đủ 1 lít.
Môi trường kích thích tạo bào tử DSM:KCl 1 g, MgSO4.7H2O 0,12 g, NaOH 0,06, pH = 7,6, nước cất vừa đủ 1 lít. Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Làm nguội đến 50oC, bổ sung thêm các dung dịch: 1 ml Ca(NO3)2 (1 M), 1 ml MnCl2 (0,01 M), 1 ml FeSO4 (1 mM).
Môi trường TSA khảo sát đối kháng với V. parahaemolyticus: tryticase peptone 15 g, phytone peptone 5 g, NaCl l5 g, nước cất vừa đủ 1 lít.
Môi trường thạch: thành phần như trên có bổ sung thêm 2% agar. Các môi trường trên được hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút trước khi sử dụng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập và làm thuần
Loại bỏ tế bào sinh dưỡng bằng cách tiến hành gia nhiệt mẫu trong bể ổn nhiệt ở 80oC trong 10 phút. Pha loãng mẫu đến 10-2, hút 100 µl dịch gốc và dịch đã pha loãng trải trên môi trường LB - agar. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria trên môi trường LB - agar, cho tới khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc duy nhất trên môi trường [11].
2.2.2. Phương pháp định danh Bacillus
Để xác định các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, một số thử nghiệm cho sàng lọc bước đầu được thực hiện như: nhuộm Gram [2], quan sát hình thái tế bào, nhuộm bào tử [2], thử nghiệm catalase bằng phương pháp sử dụng dung dịch H2O2 3%, thử nghiệm oxidase trên đĩa giấy có tẩm N-dimethyl-para phenylenediamine, thử nghiệm khả năng di động trên môi trường thạch mềm [3].
Sau bước sàng lọc tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA: tách chiết bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit của QIAgen, khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự như sau:
27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’).
1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’).
Sản phẩm PCR được tinh chế và gửi giải trình tự. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu các đặc tính có lợi
Khả năng sinh enzyme ngoại bào: khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường LB – agar có bổ sung cơ chất thích hợp. Tế bào của chủng Bacillus được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng ở 37oC trong 24 giờ. Chấm dịch Bacillus sau 24 giờ nuôi cấy lên đĩa môi trường LB – agar có bổ sung từng loại cơ chất: 0,5% CMC (carboxy methyl cellulose), 1% tinh bột, 1% gelatin, 1% casein, 1% (v/v) dầu oliu tương ứng cho khảo sát khả năng sinh các enzyme cellulase, amylase, protease và lipase. Ủ các đĩa khảo sát ở 37oC 12 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa [3].
Khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus: sử dụng phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc (Cross-streak) [8], [9] và phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch [6], [10], để khảo sát đặc tính đối kháng với vi khuẩn V. paraheamolyticus.
2.2.4. Phương pháp khảo sát đặc tính sinh trưởng
Khả năng chịu pH: cấy các chủng Bacillus tuyển chọn được trong môi trường LB được điều chỉnh pH bằng HCl và NaOH theo các giá trị pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nuôi cấy lắc ở 37oC, đo OD600 nm để xác định mật độ vi khuẩn sau 18 giờ [5].
Khả năng chịu mặn: cấy các chủng Bacillus tuyển chọn được trong môi trường LB bổ sung thêm NaCl với các nồng độ: 0, 1, 2, 3, 4, 5%. Nuôi cấy lắc ở 37oC, đo OD600 nm để xác định mật độ vi khuẩn sau 18 giờ [5].
Khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn: sử dụng phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc.
