TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM
Tô Thị Ngọc Anh
TÓM TẮT
14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cò bỏ được đem khảo sát hoạt tính trên môi trường Delafield cải tiến, sử dụng bột rơm làm cơ chất. Kết quả chọn dòng cho thấy vi khuẩn 43 cho đường kính vòng tròn thủy phân lớn nhất (13,0mm) trên môi trường nhuộm Congo-Red. Dòng 43 là vi khuẩn gram âm, cầu đôi, di động và sinh trưởng trong khoảng pH rộng 5,0-10,0, nhiệt độ 25-40oC. Tại pH 6,0, nhiệt độ 30oC, thời gian ủ 5 ngày, dòng 43 cho hoạt độ thủy phân rơm cao nhất với hàm lượng protein sinh ra 0,10mg/ml và đường khử sinh ra 0,046µg/ml.
Từ khóa: dạ cỏ bò, đường khử, kỵ khí, thủy phân, rơm.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng sản xuất lúa trọng điểm của cả nước, với diện tích trồng lúa chỉ chiếm 12,1% nhưng sản lượng lúa chiếm 51,5% và cung cấp hơn 90% lượng xuất khẩu của cả nước. Tương đương với lượng lúa gạo thì lượng rơm phát sinh là rất lớn. Ước tính lượng rơm phát sinh năm 2011 của toàn vùng ĐBSCL là 26,23 triệu tấn, trong các địa phương khảo sát thì nhiều nhất là tỉnh An Giang (4,78 triệu tấn) và thấp nhất là Cần Thơ (1,68 triệu tấn) (Tổng cục Thống kê, 2011). Khuynh hướng sử dụng rơm hiện nay của các nông hộ là: đốt rơm trên đồng, vùi trong đất, trồng nấm, bán chăn nuôi và cho rơm. Theo báo cáo của Trần Sỹ Nam (2014), hầu như tất cả người dân đều có khuynh hướng lựa chọn biện pháp đốt rơm trên đồng ruộng cho các năm tiếp theo: 98,75% (vụ Đông Xuân), 96,5% (vụ Hè Thu) và 91,25% (vụ Thu Đông). Đốt rơm rạ trên đồng ruộng chỉ tái tạo được một phần chất dinh dưỡng vô cơ cho đất, nhưng lại thúc đẩy rửa trôi chất dinh dưỡng trong đất và làm “chai đất”. Hơn nữa, đốt rơm trên các diện tích lớn ĐBSCL sẽ ảnh hưởng lớn đến môi trường đất, nước và không khí, ảnh hưởng tới sức khỏe con người, góp phần làm gia tăng biến đổi khí hậu (IPCC, 2007; Gadde et al., 2009) và gây lãng phí nguồn tài nguyên sinh khối này (Ngô Thị Thanh Trúc, 2005). Do đó, nghiên cứu xử lý rơm rạ sau thu hoạch là một vấn đề cấp thiết, đặc biệt trong thời điểm ĐBSCL đang gánh chịu những tác hại nặng nề của biến đổi khí hậu (Đoàn Thị Thu, 2014).
Cellulase là nhóm enzyme xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết β 1-4 glucoside trong mạch phân tử cellulose, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xử lý phế phẩm nông nghiệp, trong các ngành công nghiệp như trong sản xuất bia, chất tẩy, dệt, giấy, thực phẩm, nhiên liệu sinh học và cả trong y dược…(Kirk et al., 2002), (Cherry và Fidantsef, 2003). Cellulase được sinh ra bởi nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm sợi có khả năng phân hủy rất tốt các cellulase tự nhiên, tuy nhiên, vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng cao hơn nấm nên có tiềm năng lớn được dùng trong sản xuất cellulase.
Động vật nhai lại có khả năng tiêu hóa thức ăn có thành phần cellulose nhờ một hệ vi sinh vật rất phong phú, đa dạng cộng sinh trong dạ cỏ: nấm, vi khuẩn và nguyên sinh vật. Trong đó, nấm và vi khuẩn đóng góp 80% trong sự tiêu hóa thức ăn ở dạ cỏ, nguyên sinh vật chỉ chiếm 20% (Dijkstra và Tamminga, 1995). Nghiên cứu của Cheng và cộng sự (1991), Forsberg và Cheng (1992) chỉ ra Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens và Ruminococcus albus là những vi khuẩn có vai trò chính trong phân giải tế bào thực vật trong dạ cỏ. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme được sinh ra bởi các chủng Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, Penicillium, Aspergillus, Mucor và Fusarium sp., phân lập từ dạ cỏ bò, cừu và dê có thể ứng dụng trong phân giải switchgrass, một nguồn nhiên liệu tái tạo mới. Nghiên cứu của Krushna Chandra Das và Wensheng Qi (2012) cho thấy vi khuẩn Butrivibrio fibrisolvens, Streptococcus sp., và Clostidium aminophilum phân lập từ dịch dạ cỏ gia súc có thể sinh cellulase hoạt tính cao.
Từ những tiền đề và cơ sở trên cho thấy được tiềm năng to lớn của việc sử dụng vi khuẩn phân lập từ dạ cỏ bò phân giải rơm rạ sau thu hoạch để sản xuất cellulase. Biện pháp này không chỉ nghiên cứu hướng xử lý nguồn rơm thải bỏ mà còn tận dụng nguồn tài nguyên sinh khối dồi dào ở ĐBSCL, đem lại hiệu quả kinh tế.
Mục tiêu đề tài: tuyển chọn được dòng vi khuẩn phân lập từ dạ cỏ bò có khả năng thủy phân rơm hiệu quả cao. Những yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn và khả năng thủy phân rơm đều được tiến hành nghiên cứu.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Rơm: Mẫu rơm thu được tại huyện Cờ đỏ, quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ. Rơm được xử lý rửa sạch chất bẩn, sấy khô và nghiền thành bột mịn để làm cơ chất nuôi vi khuẩn.
Nguồn vi khuẩn: 14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ trâu bò, được đánh số 30, 31, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 49, 50, 51, 52. Vi khuẩn được trữ bằng glycerol 20%, nhiệt độ -20oC, tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí
Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch Delafield (2002) cải tiến, thành phần 5g/l CMC (Carboxymethyl Cellulose), 1g/l (NH4)2SO4, 1g/l K2HPO4, 0,5g/l MgSO4.7H2O, 0,001g/l NaCl. Vi khuẩn được ủ trong bình hút ẩm bên trong có đặt một ngọn lửa đèn cầy để loại bỏ hoàn toàn oxy trong bình, tại nhiệt độ phòng, trong 2 ngày. Cấy chuyền vi khuẩn qua nhiều lần cho đến khi thu nhận được từng dòng vi khuẩn thuần nhất. Tiến hành mô tả hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, quan sát hình dạng và chuyển động của vi khuẩn.
2.3. Xác định khả năng thủy phân rơm của 14 dòng vi khuẩn
Thử khả năng thủy phân rơm của 14 dòng vi khuẩn phân lập. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần cho mỗi dòng vi khuẩn. Cấy vi khuẩn sang dịch môi trường Delafield (2002) cải tiến bổ sung 0,5% bột rơm và để ổn định tại nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Cấy vi khuẩn sang môi trường agar Delafield 0,5% bột rơm, ủ trong 5 ngày, nhiệt độ phòng. Sau đó, các đĩa petri được với nhuộm Congo Red để đánh giá khả năng thủy phân cellulose có trong rơm của các dòng vi khuẩn kỵ khí thông qua độ lớn của đường kính vòng tròn thủy phân. Việc kiểm tra hoạt tính cellulase bằng việc đo đường kính vòng tròn thủy phân được tiến hành theo phương pháp đã miêu tả bởi Laurent et al. (2000).
2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến dòng vi khuẩn tuyển chọn được
2.4.1. pH và nhiệt độ
Thử nghiệm sự tương tác của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn tuyển chọn và hiệu suất thủy phân rơm. Tiến hành bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 nhân tố, lặp lại 3 lần cho dòng vi khuẩn tuyển chọn. Cấy vi khuẩn trên môi trường agar 0,5% bột rơm, pH môi trường 4,0-11,0. pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5M và HCl 6M. Ủ đĩa petri tại điều kiện nhiệt độ 25-50oC, trong 5 ngày và tiến hành so sánh đường kính đường tròn thủy phân để xác định pH và nhiệt độ thích hợp.
2.4.2. Thời gian nuôi cấy
Thử nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của dòng vi khuẩn trên rơm để đạt được hiệu quả thủy phân cao nhất. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 7 ngày, 3 lần lặp lại cho dòng vi khuẩn khảo sát. Vi khuẩn được nuôi trong 24 ống falcon 50ml môi trường Delafield (2002) cải tiến bột rơm 0,5%. Sau mỗi ngày lấy ra 3 ống để đo mật số vi khuẩn, hàm lượng protein và đường khử sinh ra và hoạt tính CMCase.
2.4.3. Bố trí thí nghiệm và phân tích thống kê
Tất cả số liệu thu được trong đề tài được phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dưới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design). Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị trung bình được so sánh bằng việc kiểm tra thống kê khác biệt có ý nghĩa LSDT (Least Significant Difference Test) bằng phần mềm Statgraphic version 3.0.
